В полученной суспензии клето SPF-эмбриона курицы определяли фенотип клеток, оценивали жизнеспособность и цитоз. Жизнеспособность клеток с фенотипом CD34+CD45dim должна была составлять не ниже 80 %. Если этот показатель был ниже, то образец отбраковывался. Раствором натрия хлорида 0,9 % доводили концентрацию клеток в образце до 1,0х106+0,25х106 в 1мл.
Настоящее изобретение относится к физиологии, медицине, хирургии, травматологии, клинической фармакологии и может использоваться для изготовления биотехнологического средства, ускоряющего заживление ран различной этиологии после оценки эффективности воздействия на процесс репарации.
Действующее вещество для активации получали авторским способом, описанным выше [51].
В контрольных образцах клеток линии ТНР-1 относительное содержание живых клеток составляло 96,53±0,46 %. Внесение вещества в финальной концентрации 350 мкг/мл сопровождалось достоверным снижением (р<0,001) относительного содержания жизнеспособных клеток до 91,72±0,44 %. Более того, отмечено достоверное увеличение относительного содержания клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза (3,16±0,19 % против 1,99±0,39 % в контроле, р=0,024), а также погибших клеток (поздний апоптоз/некроз), показавших превышение более чем в 4 раза при сравнении с контрольными образцами (5,12±0,28 % и 1,47±0,21 % соответственно, при р<0,001).
Действующее вещество применялось в финальной концентрации 70 мкг/мл, было отмечено достоверное двукратное увеличение (р=0,009) клеток, находящихся на терминальных стадиях апоптоза и в некрозе (2,69±0,29 %). Биотехнологическое средство в финальной концентрации 7 мкг/мл не оказывал достоверное влияние ни на один из исследованных показателей (рис. 3.21 и рис. 3.22).
Внесение в среду для культивирования камптотецина, индуктора апоптоза, в финальной концентрации 1 мкМ сопровождалось снижением (р<0,001) относительного содержания жизнеспособных клеток до 31,58±1,68 %, а также увеличением относительного содержания клеток на ранних и поздних стадиях апоптоза (до 30,12±1,94 % и 38,30 % соответственно). Вместе с тем в присутствии препарата в финальной концентрации 350 мкг/мл уровень жизнеспособных клеток увеличивался (р=0,001) и достигал значений в 45,11±2,17 %. Более того, относительное содержание ТНР-1, находящихся на ранних стадиях апоптоза, снижалось до 21,49±2,15 % (р=0,018), а клеток, находящихся на стадии позднего апоптоза и некроза – до 33,40±2,49 % (р=0,165). Внесение препарата в концентрациях 70 и 7 мкл/мл не оказывало достоверного влияния на распределение клеток по фазам апоптоза (рис. 3.21 и рис. 3.22).
Рисунок 3.21. Характеристика зависимости раннего апоптоза клеток от концентраций веществ. Градиентная заливка поверхности позволяет оценивать отдельное и комбинированное действие биотехнологического средства и камптотецина. Синим цветом обозначены области с низким процентом гибели клеток, а красным – области с высоким процентом гибели.
Рисунок 3.22. Характеристика зависимости позднего гибели клеток в результате апоптоза и некроза от концентраций веществ. Коричневым цветом обозначены области с низким процентом гибели клеток, а фиолетовым – области с высоким процентом гибели.
В рамках эксперимента концентрация камптотецина в клетки была понижена до 0,2 мкМ, что привело к увеличению относительного содержания живых клеток до 47,76±3,17 %, тогда как на ранних и поздних стадиях апоптоза находилось уже 20,75±2,40 % и 31,49±1,31 % клеток соответственно. Инкубация ТНР-1 в присутствии камптотецина и препарата в финальной концентрации 350 мкг/мл достоверно не влияла на жизнеспособность клеток (51,11±1,49 %, р=0,367), однако сопровождалась почти двукратным снижением относительного содержания клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза (до 12,86±2,00 при р=0,036). По остальным концентрациям вещества достоверных изменений жизнеспособности клеток линии ТНР-1 отмечено не было.
В результате проведенных исследований были получены данные о дозозависимом влиянии концентрации действующего вещества разработанного биотехнологического средства ксеногенного происхождения на жизнеспособность и процессы апоптоза клеток в культуре [112]. То есть репаративный процесс может быть управляемым.
Этот результат позволил спланировать и провести исследование в условиях экспериментального заживления ран с участием лабораторных животных.
Формирование инфицированных ран у лабораторных животных проводили в стандартных условиях: всем кролам, под общим эфирным обезболиванием, по паравертебральной линии с помощью металлической̆ пластины с внутренним диаметром кольца 2,0 см, иссекали шкуру (рис. 3.23).
Рисунок 3.23. Подготовка лабораторного животного к эксперименту с моделированием инфицированной̆ раны мягких тканей
Полученный дефект обрабатывали 70 % уксусной кислотой до получения некроза подкожной клетчатки и мышц (рис. 3.24).
Рисунок 3.24. Состояние ран после обработки 70 % уксусной кислотой, первые сутки эксперимента.
Затем в рану вносили 500 тыс. КОЕ St. Aureus. Таким образом, спустя двое суток, к началу эксперимента, у всех животных были сформированы раны неправильно округлой формы до 200 мм2 (рис. 3.25).
Рис. 3.25. Моделирование инфицированной раны мягких тканей
Вокруг раны очаг инфильтрации – до 300 мм2. Стенки раны гиперемированы, плотные, спаяны с окружающими тканями, дно покрыто плотным налетом фибрина, выделяется до 2–3 мл гнойного отделяемого белесоватого цвета тестоватой консистенции. Глубина раневого дефекта достигала 2 см.
В день формирования раны, под местной анестезией, выполняли биопсию раны через все слои на глубину до 1,8–2,2 см. Материал фиксировали в 96 % этиловом спирте, заливали в парафин и готовили гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином Майера и эозином с последующим анализом морфологической картины [41].
До начала лечения у всех животных при гистологическом исследовании определялись очаги некроза в соединительной и мышечной тканях (рис. 3.26), расширение кровеносных сосудов со стазом крови, экссудация лейкоцитов.
Рисунок 3.26. Характеристика ран до начала лечения. Окраска – гематоксилин Майера и эозин. УвХ 40. Очаги некроза в соединительной и мышечной тканях.
Сосочковый слой дермы имел четкое разграничение на слои: с выраженной клеточной инфильтрацией, представленной моноцитами, единичными макрофагами, и рыхлой соединительной тканью с большим количеством фиброцитов, единичными фибробластами, единичными моноцитами, плазмоцитами, очаги некроза замещены полиморфно-ядерными лейкоцитами, при этом также определяются и мононуклеарные лимфоциты (рис. 3.27).
Рисунок 3.27. Характеристика ран до начала лечения. Окраска – гематоксилин Майера и эозин. УвХ 40
Лечение животных начинали через пять суток после формирования инфицированной раны мягких тканей. Животные были разделены на четыре группы: экспериментальная группа и три группы контроля (по 20 кролов в каждой). В каждой группе один раз в сутки выполняли перевязку с определенным для каждой группы типом лечения:
При визуальном наблюдении в процессе заживления ран были отмечены некоторые отличия общего состояния и поведения животных сравниваемых групп. Характерной особенностью поведенческих реакций животных экспериментальной группы было усиление двигательной активности, увеличение объема потребляемой пищи и улучшение шерстного покрова.
На первые, третьи, пятые, седьмые, десятые и пятнадцатые сутки оценивали размеры раневого дефекта, наличие отека, гиперемии, отделяемого из раны и его характер.
Во всех группах контроля на первые сутки раны сохраняли свои размеры. При этом стенки ран сохраняли свою плотность, спаяны с окружающими тканями, вокруг раны сохраняется плотный инфильтрат, при механическом воздействии из раны выделяется гной, дно раны покрыто гнойной пленкой (рис. 3.28).
Рисунок 3.28. Состояние инфицированной раны мягких тканей в первые сутки эксперимента
На первые сутки в группе I (экспериментальной) раневой дефект сохранял свои размеры до 150 мм2. Вокруг раны сохранялась умеренная гиперемия кожи, стенки раны были мягкие при пальпации, дно раны было покрыто налетом фибрина, гноя не наблюдалось (рис. 3.29).
Рисунок 3.29. Состояние инфицированной раны мягких тканей животных в группе I (экспериментальной). Первые сутки лечения
На третьи сутки наблюдалось уменьшение размеров дефекта ткани до 60 мм2, рана покрыта струпом бледно-серого цвета, вокруг зона краевой эпителизации до 5,0 мм шириной (рис. 3.30).
Рисунок 3.30. Состояние инфицированной раны мягких тканей в группе I (экспериментальной). Третьи сутки эксперимента.
В экспериментальной группе I на пятые сутки эксперимента наблюдалось закрытие раны более чем на 70 % и отмечалась краевая эпителизация с оволосением (рис. 3.31).
Рисунок 3.31. Состояние инфицированной раны мягких тканей в группе I животных. Пятые сутки эксперимента.
В экспериментальной группе I на десятые сутки эксперимента наблюдалась полная эпителизация раневого дефекта с его оволосением, гистологическая картина эпителизации раны с сохранением всех функционирующих структур. Эпителизация раны происходила без образования соединительнотканного рубца с восстановлением функции поврежденного участка, подтверждаемой ростом волосяного покрова (рис. 3.32).
Рисунок 3.32. Состояние инфицированной раны мягких тканей животных в экспериментальной группе I. Десятые сутки эксперимента.
У животных II группы (контроль основы) раны сохраняли свои размеры до десяти суток эксперимента, при гистологическом исследовании определялся отек, лимфогистиоцитарная инфильтрация и дегенеративно-дистрофические изменения подкожной клетчатки, мышечного слоя (рис. 3.33). Закрытие раневого дефекта не происходило. Как видно на фото, в эти сроки несколько сокращались размеры раневого дефекта (180-200 мм2), рана была покрыта налетом фибрина, края и стенки раны были плотные.
Рисунок 3.33. Состояние инфицированной раны мягких тканей в II группе животных (контроль основы). Десятые сутки эксперимента. 25 сутки эксперимента.
В группе III (традиционное лечение) в течение раневого процесса прослеживались все фазы: экссудации, пролиферации и регенерации (рис. 3.34).
Рисунок 3.34. Состояние инфицированной раны мягких тканей в III группе животных (традиционное лечение). 20 сутки эксперимента.
Закрытие раневого дефекта произошло к 25 суткам с формированием грубого соединительнотканного рубца (рис. 3.35).
Рисунок 3.35. Состояние инфицированной раны мягких тканей в III группе животных (традиционное лечение). 25 сутки эксперимента.
В группе IV у пяти животных на 5 сутки развилась флегмона подкожной клетчатки, что привело к гибели животных. У оставшихся животных добиться закрытия раневого дефекта к 25 суткам эксперимента не удалось и животные были выведены из эксперимента (рис. 3.36).
Рисунок 3.36. Состояние инфицированной раны мягких тканей. 25 сутки эксперимента. Группа IV. Раны сохраняют свои размеры, дно раны покрыто некротическими массами, из раны обильно выделяется гнойное отделяемое.
В экспериментальной группе (I) после применения действующего вещества биотехнологического средства, очищение раны от гнойно-некротических тканей происходило на 1–3 сутки лечения, а эпителизация раневого дефекта заканчивалась к 5–7 суткам эксперимента, с восстановлением волосяного покрова. В группах контроля очищение раны от гнойно-некротических тканей происходило к 15–20 суткам (группа II – контроль основы), закрытие раневого дефекта с формированием грубого соединительнотканного рубца – к 20–30 суткам (группа III – традиционное лечение) (рис. 3.37).
Рисунок 3.37. Визуальное сравнение динамики состояний при лечении инфицированной раны мягких тканей. Группа III (традиционное лечение) – верхний ряд и группа I (экспериментальная) – нижний ряд.
Таблица 3.5. Сравнительная характеристика размеров площади ран на последовательных этапах заживления
Таким образом, эффект применения действующего вещества биотехнологического средства ксеногенного происхождения на данном этапе наблюдений позволяет сделать вывод об его стимулирующем влиянии на репарацию. Визуальные наблюдения были сопоставлены с гистологическими изменениями ран.
При гистологическом исследовании, на третьи сутки у животных в экспериментальной группе I в ране определялась рыхлая соединительная ткань с лейкоцитарной инфильтрацией, единичными укрупненными фибробластами, лимфоцитами, плазмоцитами, эозинофилами и моноцитами. Очаги пролиферации эндотелия сосудов были без просвета, с многорядностью расположения ядер (рис. 3.38).
Рисунок 3.38. Пятые сутки эксперимента. Экспериментальная группа I. Окраска – гематоксилин Майера и эозин. УвХ 90
На 10 сутки эксперимента гистологически отмечалась пролиферативная активность клеток фибробластического ряда, трубчатая пролиферация фибробластов и эндотелия сосудов. В подкожной клетчатке определялись неповрежденные нервные стволики, что соответствовало гистологической картине эпителизации раны с сохранением всех функционирующих структур (рис. 3.39).
Рисунок 3.39. Экспериментальная группа I. Десятые сутки эксперимента. Окраска – гематоксилин Майера и эозин. УвХ 20
У животных II группы (контроль основы), до десятых суток эксперимента определялся отек, лимфогистиоцитарная инфильтрация и дегенеративно-дистрофические изменения подкожной клетчатки, мышечного слоя (рис. 3.40).
Рисунок 3.40. Группа II (контроль основы). Десятые сутки эксперимента. Окраска – гематоксилин Майера и эозин. УвХ 20
В группе III (традиционное лечение) к 25 суткам сохранялись дегенеративно-дистрофические изменения подкожной клетчатки и мышц, дегенеративные изменения нервных стволиков (рис. 3.41).
Рисунок 3.41. Группа III (традиционное лечение). 25 сутки. Дегенеративные изменения нервных стволиков. Окраска – гематоксилин Майера и эозин. Увеличение 40.
Гистологический контроль показал, что формирование грануляционной ткани происходит от краев дефекта к центру раны, поэтому она имеет очаговое расположение и отличается полиморфизмом клеточных элементов, среди которых встречаются нейтрофильные лейкоциты, макрофаги и гистиоциты. Основу грануляционной ткани составляют единичные вертикально расположенные капилляры, имеющие различный диаметр, стенка которых состоит из одного ряда эндотелиальных клеток. Встречаются единичные фибробласты, которые в глубоких слоях раны принимают перпендикулярное по отношению к сосудам положение. Малодифференцированные фибробласты имеют типичное строение: веретеновидную форму и крупное ядро с небольшим объемом цитоплазмы. Ориентированы в различных направлениях в грануляционной ткани и не образуют скоплений. Сама ткань выглядит отечной, отчетливо выражена лейкоцитарная инфильтрация не только в поверхностных слоях, но и в области дна. Одновременно с формированием новообразованной ткани начинается эпителизация раны, степень которой тесно связана с ее гранулированием. Регенерация эпителия характеризуется тремя процессами: миграцией клеток, их пролиферацией и последующей дифференцировкой. Растущий эпителий имеет вид клина, истонченного в сторону центра раны, со слабо выраженной гипертрофией на границе с неповрежденной кожей. Очаговый характер молодой ткани и ограниченная площадь определяют и незначительную протяженность регенерирующего эпителия.
У животных экспериментальной группы I, течение посттравматической репарации было более благоприятным, что находило отражение в морфологическом строении всех структур полнослойного дефекта. Струп был неоднороден, образован только клеточным детритом и не содержал участков, заполненных плазмой. Лейкоцитарный вал содержал находящиеся на стадии физиологической дегенерации нейтрофилы. Грануляционная ткань животных имела очаговый характер, но занимала большую площадь. Новообразованная ткань характеризовалась мощным развитием кровеносных сосудов и пролиферацией фибробластов. Клеточные элементы фибробластического ряда были представлены крупными вытянутыми многоотростчатыми клетками, что свидетельствовало об их высокой функциональной активности. Они были ориентированы параллельно поверхности раны, что особенно было выражено в периферических участках и глубоких слоях раневого дефекта. В составе межклеточного вещества увеличивалось количество коллагеновых волокон, которые агрегировались в пучки.
Таким образом, при применении биотехнологического средства ксеногенного происхождения (Группа I) отмечалось выгодное от остальных групп животных равномерное формирование соединительной ткани по всему дефекту. Эпителизация проходила успешно – эпидермис имел все признаки дифференцировки, дистрофически не изменился. Подкожная жировая клетчатка в воспалительные процессы не была вовлечена. Реструктуризация дермы происходила с нарастанием пула грануляций, стимуляцией миграции и пролиферации фибробластов, кератиноцитов, эндотелиальных и других клеток, что способствовало восстановлению ткани, сокращению времени репарации и отсутствию осложнений.
В процессе заживления ран на этапе гнойно-некротической фазы преобладающей формой клеток был нейтрофильный клеточный пул, что обеспечивало активное противостояние бактериальной флоры и иммунной системы. Для перепроверки этих фактов идентифицировались клетки, экспрессирующие на мембране рецептор СD4+. Общее количество клеток данной субпопуляции снижается по сравнению с клетками здоровой кожи (9,33±0,26 и 13,85±0,19 соответственно).
Известно, что рецепторы СD4 присутствуют преимущественно на Т-лимфоцитах и, будучи комплементарными HLA-антигенам II класса, обеспечивают контакт Т-клеток с макрофагально-гистиоцитарным микроокружением. В процессе заживления раны наблюдалось периваскулярное разрежение Т-клеток по сравнению с нормальной здоровой кожей.
Также уменьшалось количество антиген представляющих клеток Лангерганса СD68+ (25,7±0,29 и 34,0±0,32 соответственно), а следовательно, и их способность вступать в межклеточные взаимодействия при реализации адаптивного иммунного ответа. Снижалась миграционная активность клеток СD68+, на их поверхности уменьшалось число молекул адгезии, продуктов генов главного комплекса гистосовместимости II класса и костимулирующих молекул.
Нарушение хода физиологической регенерации и появление участков гипертрофии связано с нарушением функции антигенпрезентации клеток Лангерганса, их расположением в подлежащей эпителию соединительной ткани на фоне снижения количеств, что может свидетельствовать о нарушении антигенпредставления в структурах кожи человека и последующем снижении контроля за физиологической и репаративной регенерацией в целом, запуске процесса адаптивной гипертрофии в структурах кожи для сохранения барьерных свойств эпителия. Наблюдалось снижение пула тучных клеток СD204+ (2,17±0,2 и 4,0±0,18 соответственно), а также их дегрануляция. Численность моноцитов кожи СD14+ достоверно увеличивалась: 11,5±1,4 в ране и 4,34±0,49 в контроле.
В условиях повреждения кожи возникает повышенный запрос ткани на миграцию макрофагов для фагоцитоза некротизированных клеток, а также для защиты от контаминирующих микроорганизмов. Регенераторный процесс в коже сопровождается ее поражением и ремоделированием, вызванным хроническим воспалением. Эти изменения кожи связаны с утолщением и увеличением осаждения коллагена в дерме. В фазу эпителизации происходит восстановление кожного покрова с формированием рубца и окончательное заживление раны. В зоне раны и подлежащей верхним слоям соединительной ткани визуализировались активированные макрофаги, характеризующиеся экспрессией СD163+, и фибробласты, отвечающие за реструктуризацию кожного покрова. Для обеспечения максимальной защиты раны от внешних воздействий и полноценной регенерации появляются СD8+-лимфоциты, продуцирущие те же цитокины, что и СD4+-Th1 (TNF-α и TNF-β, IL-2,3, IFN-γ, ГМ-КСФ).
Это наблюдение устанавливает роль клеток кожи в процессе репаративной регенерации в условиях гнойно-инфицированной раны. В частности, выявлено угнетение T-клеточного звена, снижение количества клеток Лангерганса и тучных клеток кожи в фазу воспаления, что приводит к извращению антигенпрезентации и нарушению в дальнейшем иммунных клеточных взаимодействий, а также нормального хода регенерации эпидермиса и дермы.
Кроме того, в экспериментальной группе I при применении биотехнологического средства на 1–3 сутки эксперимента наблюдался рост носителей CD95+ с последующим его снижением, начиная с 3–5 суток. С первых суток наблюдался рост носителей маркера Ki67+ и продолжался до 15 суток эксперимента. На 3–5 сутки возникает «перекрест маркеров», что характеризует переход первой фазы раневого процесса во вторую: завершение процессов гибели клеток и начало активных пролиферативных процессов. В группе контроля традиционного лечения наблюдалось снижение уровня маркера готовности клеток к апоптозу. На пятые сутки эксперимента отмечался всплеск уровня маркера пролиферации с дальнейшим его снижением практически до нуля. В эпидермисе рубцов обнаруживались активные процессы пролиферации. Метка локализовалась в ядрах клеток базального и шиповатого слоя. В дерме метка присутствовала в округлых клетках. Они имеются в сосудах и между коллагеновыми волокнами зоны роста. Возможно, это клетки фибробластического ряда. Экспрессия белка Fas, свидетельствующая о том, что эпидермоциты готовы к апоптозу, была обнаружена в клетках базального и шиповатого слоя. В дерме метки не наблюдалось.
Значительное (в пять раз) ускорение очищения раны в первую фазу раневого процесса в экспериментальной группе I по сравнению с группами контроля, а также эпителизация раны без образования соединительнотканного рубца с восстановлением функции поврежденного участка (рост волосяного покрова) связаны с индуцирующим влиянием биотехнологического средства ксеногенного происхождения на способ гибели клеток в первую фазу раневого процесса и характеризуют потенцирование механизмов репаративной регенерации. Это подтверждается и данными полученными при иммуногистохимическом исследовании. До начала лечения количество клеток, экспрессирующих маркер CD95+ и маркер пролиферации – Ki67+, было одинаково высоко во всех экспериментальных группах. Динамика проапоптотического маркера CD95+ и маркера готовности клеток к пролиферации Ki67+ представлена в табл. 3.6 и 3.7.
Таблица 3.6. Динамика проапоптотического маркера CD95+
До начала лечения во всех группах выявлялся одинаковый уровень маркера CD95+. На первые сутки эксперимента в I группе уровень маркера CD95+ вырастал в два раза – 10 % – и оставался высоким до пяти суток (5–8 %).
Таблица 3.7. Динамика маркера готовности клеток к пролиферации Ki67+
Начиная с третьих суток в I (экспериментальной) группе нарастал уровень Ki67+ (4–5 %) и сохранил свои значения до 15 суток эксперимента (8–11 %). В группе II (контроль основы) наблюдался умеренный рост CD95+ и Ki67+, в группе III (традиционное лечение) на 3–5 сутки уровень маркеров не отличался от исходного.
До 15 суток эксперимента в экспериментальной группе I сохранялся высокий уровень Ki67+ (8–11 %), в группах контроля уровень CD95+ и Ki67+ стремился к нулю (0–4 %).
При этом, исследуя количество лимфоцитов с активированным CD95+, установили одинаковый уровень маркера во всех группах до начала лечения (рис. 3.42).
Рисунок 3.42. Уровень CD95+ инфицированных ран мягких тканей в группах сравнения до лечения
Также во всех группах наблюдался примерно одинаковый уровень маркера пролиферации – Ki67+ (рис. 3.43).
Рисунок 3.43. Уровень Ki67+ инфицированных ран мягких тканей в группах сравнения до лечения
В экспериментальной группе I при применении клеток-предшественниц на 1–3 сутки эксперимента наблюдался рост носителей CD95+ с последующим его снижением, начиная с 3–5 суток. С первых суток наблюдается рост носителей маркера Ki67+и продолжался до 15 суток эксперимента. На 3–5 сутки возникает «перекрест маркеров» (рис. 3.44), что характеризует переход первой фазы раневого процесса во вторую: завершение процессов гибели клеток и начало активных пролиферативных процессов.
Рисунок 3.44. Группа I (экспериментальная). Динамика маркеров апоптоза и пролиферации при применении клеток-предшественниц в лечении инфицированной раны мягких тканей
В группе II (контроль основы) к 3–5 суткам наблюдался резкое падение как маркера готовности клеток к апоптозу, так и маркера пролиферации (рис. 3.45).
Рисунок 3.45. Группа II (контроль основы). Динамика маркеров апоптоза и пролиферации
В группе III (традиционное лечение) наблюдался снижение уровня маркера готовности клеток к апоптозу, на пятые сутки эксперимента отмечается некоторый всплеск уровня маркера пролиферации с дальнейшим его уменьшением практически до нуля (рис. 3.46).
Рисунок 3.46. Группа III (традиционное лечение). Динамика маркеров апоптоза и пролиферации
В группе IV (без лечения) к 3–5 суткам наблюдался резкое падение как маркера готовности клеток к апоптозу, так и маркера пролиферации (рис. 3.47).
Рисунок 3.47. Группа IV (без лечения). Динамика маркеров апоптоза и пролиферации
Таким образом, исследуемое биотехнологическое средство является индуктором апоптоза в первую фазу раневого процесса. Во вторую и третью фазы раневого процесса данное вещество индуцирует механизмы физиологической репаративной регенерации.
Дополнительно было установлено, что для получения отчетливого эффекта в составе клеточной суспензии – источнике молекул адгезии, должна содержаться определенная концентрация клеток фенотипа CD34+CD45dim. При попытке уменьшения концентрации клеток фенотипа CD34+CD45dim ниже 0,75×106/мл значительно снижался репарационный эффект. В свою очередь повышение концентрации выше 1,25×106/мл не приводило к существенному увеличению эффективности.
Применение этих свойств в качестве индукторов апоптоза и пролиферации открывает новые перспективы регуляции раневого процесса. В том числе в инфицированных ранах.
Прежде чем приступить к клиническим испытаниям, необходимо было провести доклинические исследования готового биотехнологического средства, представленного в виде супернатанта клеток шестидневного SPF-эмбриона курицы шестого дня гестации в концентрации от 0,75×106 до 1,25×106 клеток фенотипа CD34+CD45dim в 1 мл гелеобразующего биополимера на основе гидроксиэтилцеллюлозы.
Содержание токсичных компонентов было оценено в двух независимых лабораториях. Результаты испытаний методом газовой хроматографии с использованием прибора «Кристалл-2000 М» отражены в Протоколе лабораторных испытаний № 374 КХ Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии ФБУ «Государственный региональный центр стандартизации, метрологии и испытаний в Москве и московской области» от 21.06.2021 (Приложение 9) и представлены в таблице 3.8.
Таблица 3.8. Оценка содержания токсичных веществ в биотехнологическом средстве «Cellgel» методом газовой хроматографии с использованием прибора «Кристалл-2000 М» (Протокол лабораторных испытаний № 374 КХ Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии ФБУ «Государственный региональный центр стандартизации, метрологии и испытаний в Москве и московской области» от 21.06.2021)
Результаты испытаний методами атомно-абсорбционной спектрометрии «PinAAcle 900F» и «МГА-915М» с ртутно-гидридной приставкой РГТ-915 и газовой хроматографии с использованием приборов «GC 2010 Plus» и «Кристалл-2000 М» отражены в Протоколе лабораторных испытаний №62Л/З-31.01/23 от 31.01.2023 Испытательной лаборатории "LIGHT GROUP" Испытательного центра "CERTIFICATION GROUP" Регистрационный № RA.RU.21A63 от 31.05.2016 (Приложение 10) и представлены в таблице 3.9.
Таблица 3.9. Оценка содержания токсичных веществ в биотехнологическом средстве «Cellgel» методами атомно-абсорбционной спектрометрии «PinAAcle 900F» и «МГА-915М» с ртутно-гидридной приставкой РГТ-915 и газовой хроматографии с использованием приборов «GC 2010 Plus» и «Кристалл-2000 М» (Протокол лабораторных испытаний №62Л/З-31.01/23 от 31.01.2023)
Оценка бактериальной обсемененности проводилась методом прямого посева в двух независимых лабораториях.
Результаты испытаний отражены в Протоколе лабораторных испытаний № 374 КХ Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии ФБУ «Государственный региональный центр стандартизации, метрологии и испытаний в Москве и московской области» от 21.06.2021 (Приложение 9) и в Протоколе лабораторных испытаний №62Л/З-31.01/23 от 31.01.2023 Испытательной лаборатории "LIGHT GROUP" Испытательного центра "CERTIFICATION GROUP" Регистрационный № RA.RU.21A63 от 31.05.2016 (Приложение 10), а также представлены в таблице 3.10. и 3.11 соответственно.
Таблица 3.10. Оценка бактериальной обсемененности биотехнологического средства «Cellgel» методом прямого посева (Протокол лабораторных испытаний № 374 КХ Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии ФБУ «Государственный региональный центр стандартизации, метрологии и испытаний в Москве и московской области» от 21.06.2021)
Таблица 3.11. Оценка бактериальной обсемененности биотехнологического средства «Cellgel» методом прямого посева Протокол лабораторных испытаний №62Л/З-31.01/23 от 31.01.2023)
Изучение кожно-резорбтивного действия вещества исследуемого биотехнологического средства проводили на белых беспородных мышах и белых беспородных крысах посредством погружения их хвостов в исследуемое ранозаживляющее средство на 4 часа. Оценку осуществляли визуально на основе данных местно-раздражающего действия (наличия на хвостах признаков нарушения целостности кожного покрова). Результаты испытаний отражены в Протоколе лабораторных испытаний №62Л/З-31.01/23 от 31.01.2023 Испытательной лаборатории "LIGHT GROUP" Испытательного центра "CERTIFICATION GROUP" Регистрационный № RA.RU.21A63 от 31.05.2016 (Приложение 10), а также представлены в таблице 3.12.
Таблица 3.12. Оценка бактериальной обсемененности биотехнологического средства «Cellgel» методом прямого посева Протокол лабораторных испытаний №62Л/З-31.01/23 от 31.01.2023)
В ходе испытаний, дополнительно оценивалась антибактериальная активность по методу «Определения чувствительности микробов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков» (рис. 3.48).
Рисунок 3.48. Оценка антибактериальной активности действующего вещества биотехнологического средства ксеногенного происхождения по методике «Определение чувствительности микробов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков» в отношении St. Aureus 155, E. Coli 2290, B. Cereus Jp 5832.
Получены следующие результаты (табл.3.13 – 3.15).
Таблица 3.13. Оценка антибактериальной активности антибиотиков широкого спектра действия и действующего вещества биотехнологического средства в отношении E. Coli 2290, n=10
* наблюдаемые различия статистически значимы – p<0,05
Таблица 3.14. Оценка антибактериальной активности антибиотиков широкого спектра действия и действующего вещества биотехнологического средства в отношении St. Aureus 155, n=10
* наблюдаемые различия статистически значимы – p<0,05
Таблица 3.15. Оценка антибактериальной активности антибиотиков широкого спектра действия и действующего вещества биотехнологического средства в отношении B. Cereus 5832, n=10
* наблюдаемые различия статистически значимы – p<0,05
Было отмечено, что диаметры зон подавления роста St. Aureus 155, E. Coli 2290 и B. Cereus Jp 5832 действующим веществом биотехнологического средства достоверно выше сравниваемых антибактериальных средств.
Таким образом, исследуемое биотехнологическое средство, полученное авторским способом [51], действуя как катализатор грануляционного роста, безопасно, стерильно, не токсично, запускает процессы пролиферации и дополнительно обладает антибактериальной (бактериостатической) активностью.
Эти результаты стали основой дальнейших научных исследований других ученых [112; 113; 114; 233] и результатами практического применения обнаруженных свойств в данной работе.
Ориентируясь на тезис, что процессы заживления подчиняются тем же принципам, что и процессы пролиферации и апоптоза, и регулируются через клеточно-клеточные и клеточно-матриксные сигналы и данные о дозозависимом влиянии биотехнологического средства на жизнеспособность и процессы апоптоза клеток в культуре [233], было изобретено средство для заживления ран различной этиологии Cellgel [51], в основе которого использован эффект активации клеток с фенотипом CD34+CD45dim кожи посредством избирательного воздействия молекул адгезии [47].
Контрактный выпуск разработанного средства организован в Федеральном государственном автономном научном учреждении «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН», а применение разрешено Протоколом лабораторных испытаний № 374 КХ Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии ФБУ «Государственный региональный центр стандартизации, метрологии и испытаний в Москве и московской области» от 21.06.2021 (Приложение 9), Протоколом лабораторных испытаний № 62Л/З-31.01/23 от 31.01.2023 (Приложение 10) и Протоколом испытаний № 594-12П/7-НТ от 24.12.2012 и декларациями Таможенного Союза о соответствии № ТС RU Д-RU.АЛ14.В.03012 от 25.12.2012 г. и № ЕАЭС RU Д-RU.РА01.В.56185/21 от 25.06.2021 (Приложение 12).
Перечисленные выше результаты независимых испытаний, позволили использовать обнаруженные эффекты разработанного биотехнологического средства в медицинской практике.
