БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ РАН КОЖИ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ

Классические дерматологические подходы к ранозаживлению основываются на различных видах наружной терапии, направленной на скорейшее закрытие тканевого дефекта «любой ценой», в том числе и с формированием рубца. И поскольку основные звенья раневого процесса трактуются с позиций скрытой хронической аутоиммунной патологии, терапевтические мероприятия часто сводятся к общим антибактериальным и иммуносупрессивным воздействиям. Но, исследованиями некоторых авторов было установлено прямое участие локального компартмента иммунной системы в регуляции процессов репарации тканей. Это представляет интерес к поиску способа стимуляции именно этих процессов.

Попытка исследовать репаративный процесс актуализирует глубокое изучение морфофункциональных межклеточных связей в коже человека с позиции роли иммунной системы.

Образуя обширную область контакта с внешней средой и представляя собой важнейшую барьерную ткань, ограничивающую внутреннюю среду организма, кожа человека сформировалась в самостоятельный орган иммунной системы. Клетки всех слоев кожи, занимая то или иное положение в её архитектонике, имеют значение в контексте выполняемых ими функций. Однако, если бы не способность эндотелиальных клеток расширять и восстанавливать сеть кровеносных сосудов, осуществлять рост тканей и репарацию, то выполняемые функции кожи были бы невозможны. При этом, кожа находится под постоянным многоуровневым контролем иммунной системы, который с одной стороны направлен на создание барьера, обеспечивающего элиминацию проникающих сквозь кожу чужеродных агентов (микроорганизмы, белки, аллергены, гаптены и др.), а с другой – на поддержание гомеостаза этой ткани посредством регуляции жизнедеятельности её клеток и большинства функций, реализуемых на уровне отдельных субпопуляций клеток и молекул.

Состояние эпидермиса – это видимое отражение фундаментальных процессов, протекающих в коже, будь то пролиферация, дифференцировка и/или апоптоз клеток. Так, пролиферация кератиноцитов сбалансирована их апоптозом с целью поддержания постоянного уровня толщины эпидермиса для защиты от воздействия окружающей среды, как всего организма, так и нижележащего слоя кожи – собственно дермы. Именно в эпидермисе реализуются в полной мере механизмы восстановления целостности – регенерация, протекающая непрерывно на протяжении всей жизни организма, регулируемая пределом митотических делений, и репарация, возникающая в следствии экзо- или эндогенного повреждения/поражения кожи.

Дерма, занимая промежуточное положение между эпидермисом и подкожной жировой клетчаткой, является основным плацдармом реализации большинства мембранных событий в норме, при патологии и/или повреждении кожи. И несмотря на то, что граница между дермой и ниже расположенной подкожной жировой клетчаткой не столь явная, как между дермой и эпидермисом, отличия прослеживаются, как по строению, так и функциям.

Подкожная жировая клетчатка служит в качестве смягчающей прокладки, термоизолирующей прослойки, а также для запаса жира. Жировые клетки расположены вдоль кровеносных сосудов и служат источником энергии для высокоспециализированных клеток – эндотелиальных клеток дермы, заслуживающих отдельного рассмотрения.

Кожа находится под постоянным многоуровневым контролем иммунной системы, который с одной стороны направлен на создание барьера, обеспечивающего элиминацию проникающих сквозь кожу чужеродных агентов (микроорганизмы, белки, аллергены, гаптены и др.), а с другой – на поддержание гомеостаза этой ткани посредством регуляции жизнедеятельности её клеток и большинства функций, реализуемых на уровне отдельных субпопуляций клеток и молекул.

Иммунная система кожи сочетает черты локальности функционирования и интегрированности в общую иммунную систему организма. К настоящему времени накоплена большая научная информация о роли и функциях кожи человека как важнейшего органа, участвующего в иммунном ответе организма. Реализуется этот ответ комплексно, при непосредственном участии клеток кожи, цитокинов кожи и под влиянием ряда других систем организма.

На клеточном уровне контроль иммунной системы за кожей обеспечивается высокой концентрацией в дерме клеток Лангерганса, дермальных дендритных клеток, макрофагов и  субпопуляций Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, плазматических клеток и естественных киллеров.

Синтез цитокинов, являясь важнейшей частью клеточного ответа, связан с распознаванием структурных компонентов патоген-ассоциированных молекулярных паттернов [256]. К ним относятся структурные компоненты внешней мембраны – липополисахариды, мембранные компоненты грамположительных бактерий, пептидогликаны, вирусные РНК, бактериальные ДНК.

Существует ли физическая связь между нервной системой и клетками кожи? Все приведенные в главе данные однозначно свидетельствуют, что да – имеется тесное функциональное взаимодействие между нервной системой, иммунной системой и кожей.

Иммунный ответ в коже включает три этапа: начальный и конечный, которые проходят в коже и промежуточный – в регионарных лимфатических узлах. В большинстве случаев имеет место смешанный иммунный ответ, протекающий с преимуществом того или иного пути. Среди причин, приводящих к наложению клеточного и гуморального ответа, можно выделить две основные. Во-первых, попадающий в организм чужеродный материал (вирусы, бактерии, внутриклеточные патогены), как правило, характеризуется полиантигенностью, т.е. несет не одну, а несколько антигенных детерминант. Часть из них может индуцировать клеточный иммунный ответ (антигены клеточной стенки бактерий), тогда как другая – гуморальный (токсины и продукты жизнедеятельности). Во-вторых, длительное (хроническое) поступление в организм антигенов (даже в форме моноантигена) и их персистенция могут приводить к переключению иммунного ответа с одного пути на другой.

Все три типа иммунологических нарушений (иммуноагрессия, иммунодефицит и дисбаланс) играют значительную роль при возникновении и течении ряда заболеваний кожи и определяют характер применения иммунотропных препаратов в терапии [369]. Это обстоятельство побуждает к дальнейшему изучению мембранных событий на уровне клеток и молекул, следствиями которых являются уникальные особенности клинической картины при иммуноопосредованных дерматозах.

Рассматривая репарацию эрозивно-язвенных поражений кожи как универсальный механизм, два предложенных заболевания являются крайностями одной сущности, что в перспективе рассмотрения может также вывести к универсальному механизму топической терапии данных дерматозов.

В отношении атопического дерматита накоплен большой объем информации о роли нарушений эпидермального барьера, но остаётся актуальным изучение связей процессов иммунного воспаления на уровне клеток с наблюдаемой клинической картиной. Также требуется уточнение представлений, что происходит «по ту сторону» базальной мембраны и как это выглядит снаружи в один и тот же момент времени. И, по-прежнему остается актуальным поиск и разработка новых заживляющих средств, механизм действия которых основан на сведениях о раневом процессе, протекающем в условиях иммуноопосредованного дерматоза.

Разработка и усовершенствование дифференцированного подхода индивидуально к каждому больному с учетом особенностей локального иммунного статуса, поможет вскрыть некоторые тонкие механизмы патогенеза, уточнить различия и, тем самым усовершенствовать терапию пузырчатки. Исследования по поиску новых терапевтических мишеней при пузырчатке продолжаются.

В совокупности состояния локального компартмента иммунной системы кожи становятся располагающим фактором к быстрому повреждению, утрате функций, замедлению механизмов физиологической регенерации и снижению активности репаративных процессов при повреждении.

Заживление ран является сложным многофакторным процессом, реализующимся на динамичных взаимодействиях клеток и регуляторов. Дальнейшее изучение кинетики клеток разных линий позволит оценить роль и механизмы реализации разных межклеточных коопераций, что является условием разработки новой стратегии управления раневым процессом. Наиболее перспекттивным в этом направлении выглядит изучение репаративного потенциала эпителиальных стволовых клеток – «нишевых клеток» и сигнальных молекул адгезии.

В коже вследствие клеточного обеднения и снижения синтетической активности клеток с возрастом развивается «дефицит» цитокинов, ростовых факторов, сигнальных, регуляторных молекул. Количество синтезируемых клетками информационных сигнальных молекул становится недостаточным для активации пролиферации стволовых клеток. Стволовые клетки не работают, не активизируются и не пролиферируют без активного микроокружения, то есть без достаточного количества ростовых факторов, цитокинов и сигнальных молекул. В это связи, мысль о внесении в рану кожи «внешнего» стартового сигнала, для того чтобы дать толчок к началу пролиферации и амплификации клеток росткового пула, выглядит прогностически оправданной и перспективной в качестве дополнения к топической терапии эрозивных и язвенных поражений и повреждений кожи.

Иммунные нарушения, которые играют значительную роль при возникновении дерматологических заболеваний и определяют характер их течения, создали предпосылки того, чтобы стандартная топическая терапия кожных заболеваний, протекающих с повреждением кожных покровов, пополнилась за счет иммунотропных средств, стимулирующих репаративные процессы. Это связано с объемом повреждения тканей, следствием активности заболевания, неблагоприятными наследственными факторами, наличием осложнений.

Многогранный патогенез атопического дерматита, рассмотренный ранее, обусловливает включение в базисную терапию средств иммунотропного воздействия на пролиферативный пул клеток с целью стимуляции репаративных процессов для скорейшей эпителизации поражений кожи и, тем самым, осуществить профилактику гнойных осложнений, повысить эффективность лечения, сократить его продолжительность, удлинить период ремиссии, снизить потребность в средствах активной терапии (в том числе антибактериальных) и улучшить состояние кожи и прогноз.

Остаётся актуальным установление связи иммунопатогенетических звеньев вульгарной пузырчатки и оптимизации терапии эрозивно-язвенных поражений кожи, потребность быстрого заживления эрозий с целью прекращения потери белка и развития осложнений заболевания, нередко ведущих к смерти больных. Все это обосновывает актуальность исследований по установлению степени иммунных нарушений в коже больных пузырчаткой с целью обоснования применения методов прецизионной диагностики и разработки новых эффективных способов топической терапии.

Особое значение прецизионный подход приобрел при внедрении в клиническую практику репаративных клеточных технологий. Возможность использования ксеногенных объектов в качестве сырья для создания биотехнологических средств побуждает исследователей искать новые источники стволовых клеток и синтезируемых ими молекул. Такими источниками являются, прежде всего эмбриональные ткани животных, как легко восполняемые ресурсы клеток фенотипа CD34+.

Современная дерматология, прежде всего, как наука, испытывает настоятельную потребность в прижизненных методах морфофункционального исследования кожи. Неразличимость состояний кожи на клеточном уровне и оценка клеток, фиксированных только гистологическими методами, не позволяют дерматологам в полной мере оценить динамику заболевания кожи, степень реагирования кожи на воздействия среды, функциональную активность клеточных субпопуляций кожи в условиях нормы и патологии, объективизировать критерии возрастных изменений кожи и оценить эффективность применяемых лекарственных и косметических средств.

Технические возможности проточной цитометрии, позволяющие анализировать субпопуляции клеток и идентифицировать любое их количество, а также измерять их поверхностные и внутриклеточные маркеры, оценивая их функциональное состояние, вместе с запросом врачей-дерматологов к более строгому пониманию патологических процессов на клеточном уровне обязывают к методологической стандартизации диагностических возможностей и подходов к измерению открывшегося разнообразия функциональных состояний клеточных фенотипов кожи. Новые знания в этой части могут стать основой разработки способов прецизионной диагностики и топической терапии заболеваний кожи, реализуемых на практике.

Использование сред является необходимым условием к культивированию клеток, а различные линии клеток, обладающие уникальными свойствами, являются источниками получения биологически активных веществ и молекул для решения различных задач – от наработки вирусов клетками-продуцентами до обеспечения субстратом и свойствами в разработке средств персонализированной регенеративной медицины.

Камптотецин, основой проапоптотического действия которого является подавление активности ДНК топоизомеразы, может использоваться как индуктор апоптоза клеток в культуре. Приведенные данные необходимо учитывать при изучении свойств препаратов и активных молекул, влияющих на иммунопатогенез кожи и репаративный процесс.

Культивирование клеток с целью получения функционально активных молекул может быть использовано при разработке биотехнологических средств для восстановления пораженной и/или поврежденной кожи.

Рассматривая механизмы возможного действия биотехнологического препарата с иммуномодулирующим эффектом, следует учитывать важную особенность. А именно, оно не должно обладать иммуносупрессивным действием, свойственным всем антибактериальным препаратам, оно должно восполнять недостающий компонент иммунной системы, возникший вследствие заболевания или повреждения, и должно обеспечивать достижение заявленному результату [58]. Между тем, явно ожидаемые эффекты терапии – антимикробный и симптоматический, могут быть обоснованно дополнены иммуномодулирующим компонентом [58], получить который возможно путем ксеногенного переноса биологических свойств некоторых молекул.

Разработок биотехнологических средств для топической терапии поражений и повреждений кожи в доступной литературе нам не встретилось. Целью стала разработка биологически-активного средства для интенсификации репарации эрозивно-язвенных поражений кожи при иммуноопосредованных дерматозах или поврежденной кожи травмирующим фактором и изучение репаративных свойств разработанного средства для дальнейшего практического применения в дерматологической практике.

Для решения поставленной цели научной работы и реализации задач, работа была выполнена в отделении дерматологии Многопрофильного медицинского учреждения НЕО-КЛИНИК (директор – кандидат медицинских наук, доцент С.В. Гольцов), дерматологическом отделении ГАУЗ ТО «Областной кожно-венерологический диспансер» (главный врач – кандидат медицинских наук Жвавый П.Н.).

В исследовании всего было задействовано 100 добровольцев, из них 80 условно здоровых лиц, 4 пациентов с социально-значимыми хроническими заболеваниями кожи в основе которых лежат иммунные механизмы патогенеза для оценки эффективности применения проточной цитометрии в прецизионной диагностике состояний кожи и демонстрации применения разработанного биотехнологического средства для топической терапии эрозивно-язвенных поражений кожи, 16 пациентов для демонстрации применения разработанного биотехнологического средства для топической терапии поражений кожи различной этиологии.

В экспериментальной части исследования было задействовано 80 лабораторных животных – половозрелые кролики-самцы породы Шиншилла, полученные из питомника г. Тюмени. Содержание и экспериментальные процедуры проводились в соответствии с правилами Совета Европейского сообщества (Директива 86/609/ЕЕС от 24.11.1986). 

Для решения поставленных задач в работе использовался комплекс дополняющих друг друга методов исследования: панч-биопсии, механической гомогенизации тканей, метод проточной цитометрии, метод криоконсервации тканей, метод культивирования тканей, метод иммуногистохимии, метод концептуализации предметных областей, метод двухколенного восхождения от эмпирически конкретного к теоретически конкретному через абстрактное, метод родоструктурной экспликации понятий, методы исчисления высказываний и методы статистической обработки данных.

При разработке биотехнологического средства, согласно Патенту на изобретение «Средство для заживления ран «Cellgel», способ его получения и способ лечения ран различной этиологии полученным средством» (Приложение 3), были использованы куриные инкубационные SPF-эмбрионы определенного дня гестации, свободные от специфических патогенных контаминантов, полученные с птицефабрики г. Тюмени.

Сравнение критериев диагностики при визуальном осмотре сыпи, представленных Федеральными клиническими рекомендациями (2016) с фактическими результатами цитоиммунограмм кожи из воспалительных инфильтратов у больных иммуноопосредованными заболеваниями кожи демонстрирует обоснованность оценки состояния клеток основных субпопуляций кожи у каждого отдельно взятого пациента, с его уникальным анамнезом жизни, возрастными особенностями кожи и всего организма, накопленным коморбидным фоном, особенностями иммунитета и с учетом полученного ранее лечения.

Настоящее изобретение относится к физиологии, медицине, хирургии, травматологии, клинической фармакологии и может использоваться для изготовления биотехнологического средства, ускоряющего заживление ран различной этиологии.

Выделение фенотипа необходимой субпопуляций клеток – фенотипа клеток CD34+CD45dim, позволило методически строго подойти к эксперименту избирательной активации и дальнейшему изобретению ранозаживляющего средства «Cellgel», ставшего лауреатом Всероссийского конкурса Программы «100 лучших товаров России» 

Назначение разработанного биотехнологического средства Cellgel выглядит обоснованным для топической терапии поражений кожи больных, страдающих хроническими заболеваниями кожи.

Современный этап развития косметологии и пластической хирургии всё отчетливее проявляется стремлением не только к восстановлению кожного барьера любой ценой, но и к получению лучших в функциональном и эстетическом отношении результатов. Применение разработанного биотехнологического средства Cellgel в комплексном постпроцедурном уходе пациентов выглядит перспективным и оправданным своей клинической эффективностью.

Продемонстрированный ряд примеров заживления ран различной этиологии позволяют констатировать факт эффективности практического применения нового биотехнологического средства Cellgel.

Для проведения исследований в области регенерации кожи возможно использование моделей как in vitro, так и in vivo. В коже млекопитающих преобладающими типами клеток являются фибробласты и кератиноциты. В подавляющем большинстве исследований по заживлению ран in vitro используют один или оба из этих типов клеток.