В отечественной и зарубежной медицине длительное время остается насущным спрос на научные разработки, ускоряющие ранозаживление кожи [75; 78; 86; 486; 622]. Исходя из представления о ранах, главной задачей ранозаживления всегда считалось восстановление функциональности кожи без рубцовых осложнений [36].
Механизмы репарации неразрывно связаны с воспалением и формируют с ним единую реакцию на повреждение [59; 61; 62]. Репарация является стереотипным процессом, однако имеет свои особенности в различных органах и тканях, в том числе и при заживлении кожных ран [177; 178]. Известно, что заживление около 55 % послеоперационных и 25 % посттравматических повреждений кожи заканчивается грубым рубцеванием, а у 19–26 % пациентов формируется гипертрофический рубец [253].
Причиной этого является недостаточная изученность процесса репарации кожи, а отсутствие универсального решения для ранозаживления является одним из стимулов к дальнейшему развитию биотехнологий и поводом расширить диапазон применяемых средств.
Несмотря на большое количество исследований, до настоящего времени не существует четкого представления о возможности управлять репарацией [34; 136].
Однако детали самого механизма хорошо изучены. Начиная с ранних эмбриональных стадий развития кожи, клетки делятся симметрично и параллельно базальной мембране, обеспечивая увеличение кожного покрова у растущего эмбриона, формируя одноклеточный слой. В дальнейшем клетки на базальной мембране делятся также симметрично на себе подобных, которые остаются на мембране, и асимметрично – на дифференцирующиеся клетки так, что митотическое веретено направлено перпендикулярно к базальной мембране. Образующиеся дочерние клетки оказываются в неравных условиях, так как одна из них остается прикрепленной к базальной мембране, а другая нет. Те, что остаются на мембране, чувствительны к адгезивным молекулам и через взаимодействие последних с рецепторами факторов роста поддерживают пролиферацию. Другие же через транзиторную стадию вступают на путь дифференцировки и, двигаясь вверх, в дальнейшем превращаясь в ороговевшие кератиноциты, формируют многослойность эпидермиса. По другую сторону базальной мембраны, были обнаружены клетки с фенотипом CD34+, которые при возникновении повреждения экспрессируют молекулы адгезии [455; 456]. Это ключевая область управления репарацией.
Так, гипотеза о возможной стимуляции репаративных потенций в коже путем внесения биотехнологического средства ксеногенного происхождения, предсказуемо воздействующего на механизм формирования грануляционной ткани, которая, как известно, является обязательным этапом к последующей эпителизации и формированию эстетического результата [455], может быть реализована с возможностью исследования клеток фенотипа CD34+CD45dim. Последние являются основополагающими в осуществлении эпителизации [413].
В свете всего вышесказанного, возможно, сделать заключение о том, что сигнальные молекулы играют важную роль в репаративном процессе, являясь «языком общения» клеток. Распознать этот язык помогают кластеры дифференцировки (cluster of differentiation, cluster designation, CD) – это маркеры, которые идентифицируют конкретный паттерн клеточной дифференцировки, выявляемый специфическим моноклональным антителом [434].
С учетом того, что кожа функционирует через специализацию субпопуляций клеток [27], а визуально различимые картины заболеваний кожи являются лишь следствием сложнейшего комплекса межклеточных взаимодействий, изучение фенотипа образующих ее клеток является актуальной задачей дерматологии [8]. Однако, по причине наличия уникальных связей клеток кожи, препятствующих их разделению и изучению в жизнеспособном состоянии in vitro, эта задача сложна, но решаема [48; 49; 50; 53].
В рамках соответствия требованиям Федерального закона № 180-ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах» все вновь разрабатываемые продукты, содержащие клеточные линии, должны быть стандартизованы. Главным методом оценки показателей качества биомедицинского клеточного продукта является метод проточной цитометрии [197].
Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии позволяет охарактеризовать клетки при помощи моноклональных антител и дает возможность судить об их типе и функциональном состоянии по наличию того или иного набора клеточных маркеров и по происходящим в них процессам. Проточная цитометрия – метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеивания (прямое светорассеивание – для определения относительного размера клеток или частиц; боковое светорассеивание – для оценки неоднородности внутриклеточного содержимого клетки, например, размеров ядра и гранулярности цитоплазмы) и флуоресценции (изучение клеточных маркеров с помощью меченных флюорохромными красителями антител к поверхностным и внутриклеточным компонентам клеток) [771].
Как метод измерения характеристик клеток, проточная цитометрия появилась в результате синтеза знаний о гистохимических и цитохимических методах анализа.
Информация, извлекаемая методом проточной цитометрии, позволяет судить о морфологических характеристиках клеток (размере, отношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток). Но дальнейшее развитие технологии привело к тому, что у исследователей появился в руках еще и такой инструмент, как моноклональные антитела, предоставившие возможность типировать клетки не только благодаря их морфологическим различиям, но и за счет набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для определенных клеток и их функционального состояния [257].
На основе метода проточной цитометрии стало возможным определять не только количественные параметры популяций клеток, но и их более широкий субпопуляционный состав, с высокой точностью оценивая функциональные свойства клеток иммунной системы. Оказалось, что не только ее. Открытие способа получения цитоиммунограммы кожи, позволило преодолеть эту трудность и породило возможность детального изучения клеточных субпопуляций не только периферической крови, но и кожи [53].
Очевидно также, что развитие дерматологии не представляется возможным в отрыве от клеточных технологий. При этом клеточные технологии исключительно стимулируют обновление дерматологии, которое позволяет досконально изучить процессы формирования разнообразия фенотипов клеток кожи, отражающих их специализацию и избирательность функций.
Показания, снимаемые методом проточной цитометрии, позволяют судить о морфологических характеристиках клеток (размере, отношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток), определять субпопуляционный состав и с высокой точностью оценивать их функциональное состояние [257].
Так, фенотипирование методом проточной цитометрии позволяет характеризовать клетки при помощи моноклональных антител и судить об их функциональном состоянии по наличию клеточных маркеров [257]. Две существенные особенности делают этот метод особенно ценным для практики:
Преимуществами метода проточной цитометрии являются [245]:
При этом, те же авторы [245] отмечают, что среди основных недостатков метода проточной цитометрии следует отметить необходимость и, одновременно, сложность пробоподготовки суспензии из отдельных клеток, особенно при исследовании тканей и органов.
Представляя собой интегральный инструмент определения фенотипа входящих в состав тканей клеток, в основе которого положен принцип обнаружения связи антиген – антитело, специфические антитела могут быть получены практически к любому белку (или его фрагменту), а значит, иммунофенотипирование может быть использовано для развития дерматологии. Тем более что проточная цитометрия – надежный метод быстрого анализа клеточной активности. Эта технология позволяет получить ясную картину поведения клеток и лучше понять механизмы клеточного ответа на специфические воздействия как в условиях нормы, так и патологии [257].
Метод проточной цитометрии используется для идентификации и количественного определения поверхностных маркеров клеток. Образцы клеток окрашивают флуоресцирующими моноклональными антителами и затем подвергают анализу как однородную клеточную суспензию при помощи лазера. С помощью проточной цитометрии определяют, как морфологические характеристики клеток, клеточные пигменты, ДНК и РНК, так и функциональные характеристики, соотношения белков, наличие внутриклеточных маркеров, рН и др. [363].
Проточная цитометрия незаменима при идентификации, характеристики и выделения клеток-предшественников, а также фиксации изменений в отдельных клетках их гетерогенных популяций. Идентификация и количественное определение отдельных клеточных подмножеств сопровождается мультипараметрическим анализом. Размер и неоднородность определяются прямым и боковым светорассеянием, а измерением флуоресценции маркерами фенотип клетки. Одновременное количественное определение жизнеспособности клеток проводится с использованием 7-амино-актино-мицина D (7-AAD) [245; 257].
Проточно-цитометрический анализ уже позволяет выявлять популяции клеток костного мозга, лимфоидной ткани и периферической крови пациентов [414]. Кроме того, проточная цитометрия позволяет проводить анализ подтипов клеток путем нанесения на них меток моноклональными антителами, конъюгированными с флуорохромом. Так, экспрессия CD34+ используется для характеристики стволовых клеток-предшественников в периферической и пуповинной крови, костном мозге и других тканях. А сочетание реагентов CD34+ и CD45dim широко используется в клинической практике. Это позволяет определять необходимое количество и тип требуемых клеточных популяций.
Поскольку известно, что резидентные клетки играют главную роль в гомеостазе кожи [98], выбор типа маркеров определяется задачей исследования, для решения которой необходимо выделение наиболее влияющих на патогенез изучаемого заболевания субпопуляций клеток кожи. Маркеры к моноклональным антителам, вырабатываемым принадлежащими к разным клеточным клонам клетками кожи, определяют их происхождение от разных клеток-предшественниц. Моноклональные антитела могут быть выработаны против любого природного антигена, который антитело будет специфически связывать. Ввиду этого они могут быть использованы для детекции (обнаружения) на поверхности мембран клеток, которые их экспрессируют.
Еще в начале XX века Пауль Эрлих постулировал, что если бы мог быть выработан компонент, способный селективно связывать компонент, вызывающий заболевание, то вместе с этим компонентом к патогенному организму мог бы быть доставлен токсин. И хотя в 1970-е годы уже были известны опухолевые B-лимфоциты (клетки миеломы), которые синтезировали один и тот же тип антител, а эти клеточные культуры использовались для изучения строения молекулы антитела, все же не было методики, позволявшей продуцировать идентичное антитело к заданному антигену.
Процесс получения моноклональных антител был изобретен Жоржем Келером и Сезаром Мильштейном в 1975 году [539]. За это изобретение в 1984 году они получили Нобелевскую премию по физиологии. Идея состояла в том, чтобы взять линию миеломных клеток, которые потеряли способность синтезировать свои собственные антитела, и слить такую клетку с нормальным B-лимфоцитом, синтезирующим антитела, с тем чтобы после слияния отобрать образовавшиеся гибридные клетки, синтезирующие нужное антитело. Эта идея была успешно реализована, и уже к 1982 году была предложена классификация кластеров дифференцировки (CD) – номенклатура дифференцировочных антигенов человека для идентификации и исследования поверхностных мембранных белков, обозначающих сплайсированный вариант внеклеточного домена молекулы клеточной поверхности [674].
CD-антигенами (или CD-маркерами) могут быть белки, которые служат рецепторами, участвующими во взаимодействии клеток между собой и являющимися компонентами каскада определенных сигнальных путей. Однако они могут быть и белками, выполняющими другие функции (например, белки клеточной адгезии или белки апоптоза). Список CD-антигенов, внесенных в номенклатуру, постоянно пополняется и в настоящее время содержит более четырехсот CD-антигенов и их подтипов. Cпособность моноклональных антител быть нацеленными на одну конкретную детерминанту клетки, превращает их в высокочувствительные реагенты [659].
Сегодня метод проточной цитометрии уже во всём мире рекомендован для количественной и качественной оценки популяций клеток в биологических образцах пациентов и при сертификации биологических продуктов [441].
Проточный цитометр позволяет поштучно подсчитать клетки, определить жизнеспособность и экспрессируемые ими мембранные молекулы в популяции из миллионов клеток на предмет их размера, принадлежности к той или иной популяции, степени дифференцировки или осуществляемой функции – активация, пролиферация и динамические изменения фенотипа со скоростью сбора информации до 1 000 событий в секунду в реальном времени, если взять всего одну пробу у пациента [257].
Поскольку метод напрямую сопряжен с математическим анализом, с целью минимизации ошибок при планировании цитометрического иммунофенотипирования рекомендовано определение стандартных панелей антител [634]. Это позволяет понять роль отдельных субпопуляций клеток и их функций в развитии механизмов заболевания и откроет перспективы развития их терапии в дальнейшем. Различия в иммунофенотипах уже используются для широмасштабных исследований клеток, выделенных из разных тканей:
Более того, метод проточной цитометрии широко используется для характеристики клеточных линий, находящихся в мировых коллекциях. В частности, для идентификации линии мезенхимальных клеток-предшественников жировой ткани используются следующие поверхностные маркеры: CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166, CD14, CD31, CD34, CD45, а для идентификации линии мезенхимальных клеток-предшественников из костного мозга: CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD166, CD14, CD34, CD19, CD45 [7].
При этом, в российских и зарубежных публикациях информации о подобных диагностических и исследовательских панелях маркеров для изучения субпопуляций клеток кожи не встречается.
Однако, следует отметить, что уже более десяти лет, в России применяется технология (разработана в ПАО «ИСКЧ»), использующая дермальные аутологичные фибробласты для коррекции возрастных изменений кожи (SPRS-терапия) [82; 83]. Иммунофенотип используемых фибробластов кожи, заявляют авторы, имеет высокий уровень экспрессии виментина, молекул адгезии (CD44, CD49b, CD54, CD90, CD105) и не экспрессируют маркеры прогениторных, гемопоэтических (CD34, CD45, CD133, CD117, HLA-DR, нестин) и эндотелиальных (фактор фон Виллебранда, CD106) клеток [82], а способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи удалось запатентовать только в 2012 году [53].
В настоящее время номенклатура CD завоевала официальный статус: она принята научным сообществом и одобрена Международным союзом иммунологических обществ и Всемирной организацией здравоохранения [527] и актуальный список маркеров включает 371 CD. При этом, клеточные структуры сначала идентифицируются с помощью методов молекулярной генетики или протеомики, а затем уже моделируются специфические антитела [387].
Таким образом, литературные сведения об иммунопатогенезе дерматозов масштабны, а мнения в отношении диагностики и топической терапии некоторых заболеваний кожи большей частью схожи. При этом, существуют противоречия в отношении пользы инвазивных способов диагностики, что на наш взгляд уже стимулирует необходимость дальнейшего уточнения связей клинической картины и состояния локального компартмента иммунной системы.
Технические возможности проточной цитометрии, позволяющие анализировать субпопуляции клеток и идентифицировать любое их количество, а также измерять их поверхностные и внутриклеточные маркеры, оценивая их функциональное состояние, вместе с запросом врачей-дерматологов к более строгому пониманию патологических процессов на клеточном уровне обязывают к методологической стандартизации диагностических возможностей и подходов к измерению открывшегося разнообразия функциональных состояний клеточных фенотипов кожи. Новые знания в этой части могут стать основой разработки способов прецизионной диагностики и топической терапии заболеваний кожи, реализуемых на практике.
