Дерматология — это рациональная философия о коже.
Длительное время единственным способом получения объективной информации о морфофункциональном состоянии клеток кожи оставалась инцизионная биопсия, инвазивность которой ограничивала ее применение и практически исключала динамические наблюдения.
В свою очередь, неинвазивные методы исследования кожи – корнеометрия, себуметрия, кутометрия, профилометрия, а для глубоких исследований – оптическая когерентная томография, ультразвуковая микроскопия, магнитно-резонансная томография, описывая ряд свойств кожи, не дают возможности оценить сложный комплекс межклеточных взаимодействий.
При всей своей убедительности в решении отдельных задач дерматологии они не позволяют получить достоверных сведений о функциональных различиях клеток кожи в количественном выражении. Описывая ряд свойств кожи, перечисленные методы не учитывают того, что кожа – орган иммунной системы, на который постоянно действует окружающая среда и в котором постоянно происходит сложный комплекс межклеточных взаимодействий.
По сути, экстенсивное развитие дерматологии сформировало приверженцев двух крайностей в исследовании кожи. Одни авторы, опираясь на возможность проводить исследования кожи и ее функций неинвазивными методами, лишают себя сведений на уровне клеток – там, где открывается колоссальный объем информации о природе воспалительных реакций. Другие же актуализируют инвазивные методы, которые хоть и позволяют исследовать кожу на клеточном уровне, но возможности оценить функцию клеток не дают, поскольку работают с фиксированной тканью, которая, как известно, функционально не активна.
Наблюдаемое состояние дерматологии, усугубляемое увеличением разнообразия заболеваний кожи, коморбидностью и отстающей скоростью развития методов диагностики, является отражением слабости дерматологии как теории.
В рамках существующей парадигмы дерматологии, опирающейся на визуальную диагностику, сдержанно и ограниченно использующей углубленные методы клеточной диагностики, не возникают новые концептуальные проблемы, которые бы выступали мотивами для ее развития, а не только совершенствования.
Дерматология движется в русле поиска однотипных лечебных средств, универсально удовлетворяющих практику.
Очевидно, это приносит улучшение показателей, но и одновременно свидетельствует о том, что сама парадигма исчерпала себя.
Таким образом, современная дерматология, прежде всего, как наука, испытывает настоятельную потребность в прижизненных методах морфофункционального исследования кожи, а основным методом оценки состояния кожи по-прежнему остается визуальный осмотр.
Неразличимость состояний кожи на клеточном уровне и оценка клеток, фиксированных гистологическими методами, не позволяют дерматологам современности в полной мере оценить динамику заболевания кожи, степень реагирования кожи на воздействия среды, функциональную активность клеточных субпопуляций кожи в условиях нормы и патологии, объективизировать критерии возрастных изменений кожи и оценить эффективность применяемых лекарственных и косметических средств.
Это обстоятельство делает актуальным изучение фенотипа клеток кожи, знание о котором позволит усилить диагностический инструментарий дерматолога примерно так, как это случилось во времена открытия микроскопа. Тем более что динамика увеличения разнообразия заболеваний кожи намного выше скорости активного использования новых методов диагностики. При этом технологизация и развитие таких областей медицины, как иммунология и цитология, стимулируют технологическое обновление дерматологии.
Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии позволяет охарактеризовать клетки при помощи моноклональных антител и дает возможность судить об их типе и функциональном состоянии по наличию того или иного набора клеточных маркеров и по происходящим в них процессам. Как метод измерения характеристик клеток, проточная цитометрия появилась в результате синтеза знаний о традиционных гистохимических и цитохимических методах анализа. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиагностике, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т. д.
Информация, извлекаемая методом проточной цитометрии, позволяет судить о морфологических характеристиках клеток (размере, отношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток). Но дальнейшее развитие технологии привело к тому, что у исследователей появился в руках еще и такой инструмент, как моноклональные антитела, предоставившие возможность типировать клетки не только благодаря их морфологическим различиям, но и за счет набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для определенных клеток и их функционального состояния.
Так, на основе метода проточной цитометрии стало возможным определять не только количественные параметры популяций клеток, но и их более широкий субпопуляционный состав, с высокой точностью оценивая функциональные свойства клеток иммунной системы. Оказалось, что не только ее. Открытие способа получения цитоиммунограммы кожи, отражающей состояние и функциональность ее клеток, породило возможность детального изучения клеточных субпопуляций не только периферической крови, но и кожи.
На данном этапе научного развития непосредственное наблюдение мембранных событий на поверхности клеток кожи неосуществимо, но о них можно судить по показаниям проточного цитометра, которые допустимо считать наблюдаемыми величинами. Использование высокоточного прибора позволяет исключить ошибки и субъективизм наблюдений. Это даст возможность ввести в дерматологию точное обоснование диагнозов на основе наблюдаемых феноменов и тем самым осуществить диалектический скачок от эмпирической формы диагностики заболеваний кожи к рационально-теоретической.
С учетом того, что кожа функционирует через специализацию субпопуляций клеток, а визуально различимые картины заболеваний кожи являются лишь следствием сложнейшего комплекса межклеточных взаимодействий, изучение фенотипа образующих ее клеток является актуальной задачей дерматологии. Очевидно также, что подлинное развитие дерматологии не представляется возможным в отрыве от клеточных технологий. При этом клеточные технологии исключительно стимулируют обновление дерматологии, которое позволяет досконально изучить процессы формирования разнообразия фенотипов клеток кожи, отражающих их специализацию и избирательность функций (рис. 1.6).
Рисунок 1.6. Уровни диагностики
Показания, снимаемые методом проточной цитометрии, позволяют судить о морфологических характеристиках клеток (размере, отношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток), определять субпопуляционный состав и с высокой точностью оценивать их функциональное состояние.
Так, фенотипирование методом проточной цитометрии позволяет характеризовать клетки при помощи моноклональных антител и судить об их функциональном состоянии по наличию клеточных маркеров. Две существенные особенности делают этот метод особенно ценным для практики:
характеризует гетерогенные клеточные популяции по фенотипу;
обнаруживает и характеризует события, встречающиеся с частотой 10–5 – 10–7.
Преимуществами метода проточной цитометрии являются:
возможность одновременного измерения нескольких параметров для каждой клетки;
достаточно высокая скорость проведения анализа;
выделение популяций клеток (определение как поверхностного фенотипа, так и внутриклеточных маркеров) и возможность их сортировки;
определение абсолютного и относительного содержания клеток в образце;
оценка состояния ДНК, исследование стадий клеточного цикла, степени пролиферативной активности;
одновременное изучение нескольких антигенных структур на одной клетке;
способность обнаружить и охарактеризовать редкие события и малочисленные клеточные популяции.
При этом, те же авторы отмечают, что среди основных недостатков метода проточной цитометрии следует отметить необходимость и, одновременно, сложность пробоподготовки суспензии из отдельных клеток, особенно при исследовании тканей и органов.
Открытие способа получения цитоиммунограммы кожи, позволило преодолеть эту трудность и породило возможность детального изучения клеточных субпопуляций не только периферической крови, но и кожи.
Представляя собой интегральный инструмент определения фенотипа входящих в состав тканей клеток (рис. 1.7), в основе которого положен принцип обнаружения связи антиген – антитело, специфические антитела могут быть получены практически к любому белку (или его фрагменту), а значит, иммунофенотипирование может быть использовано практически в любой области медицины, дерматология – не исключение. Тем более что проточная цитометрия – надежный метод быстрого анализа клеточной активности. Эта технология позволяет получить ясную картину поведения клеток и лучше понять механизмы клеточного ответа на специфические воздействия как в условиях нормы, так и патологии.
Рисунок 1.7. Схема работы проточного цитометра
Научная деятельность через методологию познания рассматривает реальную картину мира и служит основным способом трансформации научного знания в практическую деятельность. Реализуется это посредством изобретения методов научного исследования либо совершенствования имеющихся.
Так, метод проточной цитометрии используется для идентификации и количественного определения поверхностных маркеров клеток. Образцы клеток окрашивают флуоресцирующими моноклональными антителами и затем подвергают анализу как однородную клеточную суспензию при помощи лазера. С помощью проточной цитометрии определяют, как морфологические характеристики клеток, клеточные пигменты, ДНК и РНК, так и функциональные характеристики, соотношения белков, наличие внутриклеточных маркеров, рН и др.
Проточная цитометрия незаменима при идентификации, характеристики и выделения клеток-предшественников, а также фиксации изменений в отдельных клетках их гетерогенных популяций. Идентификация и количественное определение отдельных клеточных подмножеств сопровождается мультипараметрическим анализом. Размер и неоднородность определяются прямым и боковым светорассеянием, а измерением флуоресценции маркерами фенотип клетки. Одновременное количественное определение жизнеспособности клеток проводится с использованием 7-амино-актино-мицина D (7-AAD).
Проточно-цитометрический анализ уже позволяет выявлять популяции клеток костного мозга, лимфоидной ткани и периферической крови пациентов . Кроме того, проточная цитометрия позволяет проводить анализ подтипов клеток путем нанесения на них меток моноклональными антителами, конъюгированными с флуорохромом. Так, экспрессия CD34+ используется для характеристики стволовых клеток-предшественников в периферической и пуповинной крови, костном мозге и других тканях. А сочетание реагентов CD34+ и CD45dim широко используется в клинической практике. Это позволяет определять необходимое количество и тип требуемых клеточных популяций.
Поскольку известно, что резидентные клетки играют главную роль в гомеостазе кожи, выбор типа маркеров определяется задачей исследования, для решения которой необходимо выделение наиболее влияющих на патогенез изучаемого заболевания субпопуляций клеток кожи. Маркеры к моноклональным антителам, вырабатываемым принадлежащими к разным клеточным клонам клетками кожи, определяют их происхождение от разных клеток-предшественниц. Моноклональные антитела могут быть выработаны против любого природного антигена, который антитело будет специфически связывать. Ввиду этого они могут быть использованы для детекции (обнаружения) на поверхности мембран клеток, которые их экспрессируют.
Еще в начале XX века Пауль Эрлих постулировал, что если бы мог быть выработан компонент, способный селективно связывать компонент, вызывающий заболевание, то вместе с этим компонентом к патогенному организму мог бы быть доставлен токсин.
И хотя в 1970-е годы уже были известны опухолевые B-лимфоциты (клетки миеломы), которые синтезировали один и тот же тип антител, а эти клеточные культуры использовались для изучения строения молекулы антитела, все же не было методики, позволявшей продуцировать идентичное антитело к заданному антигену.
Процесс получения моноклональных антител был изобретен Жоржем Келером и Сезаром Мильштейном в 1975 году. За это изобретение в 1984 году они получили Нобелевскую премию по физиологии. Идея состояла в том, чтобы взять линию миеломных клеток, которые потеряли способность синтезировать свои собственные антитела, и слить такую клетку с нормальным B-лимфоцитом, синтезирующим антитела, с тем чтобы после слияния отобрать образовавшиеся гибридные клетки, синтезирующие нужное антитело. Эта идея была успешно реализована, и уже к началу 1980-х годов началось коммерческое получение различных антител против заданных антигенов.
Для распознавания антигенов в 1982 году была предложена классификация кластеров дифференцировки (англ. Cluster of Differentiation (CD)) – номенклатура дифференцировочных антигенов человека для идентификации и исследования поверхностных мембранных белков. CD-антигенами (или CD-маркерами) могут быть белки, которые служат рецепторами, участвующими во взаимодействии клеток между собой и являющимися компонентами каскада определенных сигнальных путей. Однако они могут быть и белками, выполняющими другие функции (например, белки клеточной адгезии или белки апоптоза) (рис. 1.8). Список CD-антигенов, внесенных в номенклатуру, постоянно пополняется и в настоящее время содержит более четырехсот CD-антигенов и их подтипов.
Рисунок 1.8. Схема дифференцировки лимфоцитов в зависимости от выполняемой функции
Сегодня метод проточной цитометрии уже во всём мире рекомендован для количественной и качественной оценки популяций клеток в биологических образцах пациентов и при сертификации биологических продуктов.
Почему до сих пор этому великолепному открытию не нашлось практического применения в дерматологии, остается загадкой. Особенно это парадоксально в свете того, что проточный цитометр позволяет поштучно подсчитать клетки, определить жизнеспособность и экспрессируемые ими мембранные молекулы в популяции из миллионов клеток на предмет их размера, принадлежности к той или иной популяции, степени дифференцировки или осуществляемой функции – активация, пролиферация и динамические изменения фенотипа со скоростью сбора информации до 1 000 событий в секунду в реальном времени, если взять всего одну пробу у пациента (рис. 1.9).
Рисунок 1.9. Рабочее место лаборанта, осуществляющего проточную цитометрию, характеризуется простотой организации
Поскольку метод напрямую сопряжен с математическим анализом, с целью минимизации ошибок при планировании цитометрического иммунофенотипирования было рекомендовано определение стандартных панелей антител. Это приведет к пониманию роли отдельных субпопуляций клеток и их функций в развитии механизмов заболеваний и откроет перспективы развития их терапии в дальнейшем.
Различия в иммунофенотипах уже используются для широмасштабных исследований клеток, выделенных из разных тканей:
Более того, метод проточной цитометрии широко используется для характеристики клеточных линий, находящихся в мировых коллекциях. В частности, для идентификации линии мезенхимальных клеток-предшественников жировой ткани используются следующие поверхностные маркеры: CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, CD166+, CD14-, CD31-, CD34-, CD45-, а для идентификации линии мезенхимальных клеток-предшественников из костного мозга: CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, CD166+, CD14-, CD34-, CD19-, CD45-.
При этом, в российских и зарубежных публикациях информации о подобных диагностических и исследовательских панелях маркеров для изучения субпопуляций клеток кожи не встречается.
Однако, следует отметить, что уже более десяти лет, в России применяется технология (разработана в ПАО «ИСКЧ»), использующая дермальные аутологичные фибробласты для коррекции возрастных изменений кожи (SPRS-терапия, Service for personal regeneration of skin). Иммунофенотип используемых фибробластов кожи, заявляют авторы, имеет высокий уровень экспрессии виментина, молекул адгезии (CD44, CD49b, CD54, CD90, CD105) и не экспрессируют маркеры прогениторных, гемопоэтических (CD34, CD45, CD133, CD117, HLA-DR, нестин) и эндотелиальных (фактор фон Виллебранда, CD106) клеток.
Опираясь на научные факты о том, что кератиноциты составляют более 90 % клеток верхнего слоя кожи – эпидермиса, а клетки дермы в подавляющем большинстве представлены фибробластами (фиброцитами), тучными клетками, моноцитами (макрофагами), эндотелиальными, дендритными клетками и лимфоцитами, из которых 90 % – Т-лимфоциты, расположенные в верхних слоях дермы и эпидермисе, а 10 % – В-лимфоциты с местонахождением в средних и глубоких слоях дермы, в качестве базового набора маркеров, дифференцирующих субпопуляции клеток и характеризующих динамику мембранных событий этих субпопуляций, следует считать: CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD34, CD44, CD45, CD49, CD54, CD63, CD80, CD146, CD203c; CD207, CD249.
Это решение позволило усовершенствовать метод проточной цитометрии до возможности получения оценок количественного и качественного состава отдельных субпопуляций клеток кожи.
Расположенные в эпидермисе клетки эктодермального происхождения, промежуточные филаменты которых представлены белком кератином, кератиноциты CD49f+ и их активированные формы CD49f+HLA-DR+, составляют до 90 % эпидермиса кожи у всех млекопитающих, в том числе человека. Дифференцируясь и ороговевая, популяция кератиноцитов эпидермиса кожи становится весьма гетерогенной.
Являясь клетками соединительной ткани, синтезирующими внеклеточный матрикс и расположенными в дерме, фибробласты CD45-CD14-CD44+ секретируют предшественников белков коллагена и эластина, а также мукополисахариды. Фибробласты и фиброциты – это два состояния клетки, причем первое – в активированном состоянии CD45-CD14-CD44+CD80+, второе – в менее активном состоянии, связанном с жизненными процессами и тканевым метаболизмом. В настоящее время существует тенденция называть обе формы фибробластами. Фибробласты, так же, как и кератиноциты эпидермиса, морфологически гетерогенны с различными проявлениями функций в зависимости от их расположения и деятельности. CD44 представляет собой гликопротеин, который играет важную роль в межклеточных взаимодействиях, клеточной адгезии и миграции и участвует в различных клеточных функциях, таких как активация, рециркуляция и самонаведение.
Это высокоспециализированные иммунные клетки соединительной ткани, аналоги базофилов крови, также участвующие в адаптивном иммунитете, конкретно – медиация цитотоксичного эффекта. Тучные клетки CD249+ играют важную роль в воспалительных реакциях, в частности аллергических реакциях. Так же, как и у базофилов, поверхность тучных клеток имеет рецепторы для IgE. При активации – CD249+CD63+ (например, при аллергической реакции) тучные клетки высвобождают содержимое гранул (гепарин и гистамин) в окружающую ткань (дегрануляция). Выход этих веществ приводит к изменению состояния межклеточного вещества соединительной ткани, гематотканевого барьера.
Расположенные в дерме моноциты CD45+CD14+ и их ативированные формы CD45+CD14+HLA-DR+ происходят из гемопоэтических стволовых клеток-предшественников в костном мозге. Циркулируя в кровотоке от одного до трех дней, они затем обычно перемещаются в ткани по всему телу, в том числе в кожу. Далее зрелые моноциты дифференцируются в резидентные макрофаги или дендритные клетки. И моноциты, и макрофаги являются фагоцитами, действующими в качестве неспецифических факторов защиты (врожденный иммунитет), а также, чтобы помочь инициировать конкретные защитные механизмы (адаптивный иммунитет). Моноциты и макрофаги фагоцитируют (поглощают и затем переваривают) клеточный дебрис и патогены либо, как стационарные или мобильные клетки, стимулируют лимфоциты и другие клетки иммунной системы в ответ на патоген.
Это субпопуляция дендритных клеток костномозгового происхождения, находящихся в эпидермисе и составляющих 24 % (по другим данным – 38 %) всех эпидермальных клеток.
Метод проточной цитометрии был рекомендован Европейским медицинским агентством (ЕМА, European Medicines Agency) для определения потенциала эффективности дендритных клеток при изготовлении дендритно-клеточных вакцин.
Применительно к дерматологии, содержащийся в эпителиальных тканях CD207+ представляет собой трансмембранный гликопротеин, используемый в качестве уникального маркера клеток Лангерганса. Несмотря на то, что эти клетки были описаны еще в 1868 г., глубокое изучение их морфологических и функциональных свойств связано с установлением их важных иммунологических функций в коже CD207+CD80+, CD207+HLA-DR+, CD207+CD80+HLA-DR+. Предназначенные для приема, обработки и представления информации об антигенах окружающей среды, а также об эндогенных антигенах, они относятся к моноцитарно-гистиоцитарной линии и играют центральную роль в инициации иммунного ответа. Антиген CD207+ экспрессируется только клетками Лангерганса.
Эндотелиальные клетки CD146+, расположенные в дерме и выстилающие кровеносные сосуды, обладают удивительной способностью изменять свою численность и расположение в соответствии с локальными особенностями функций кожи CD146+CD34+, CD146+HLA-DR+, CD146+CD54+, CD146+CD54+HLA-DR+. Участвуя в организации кровообращения, эти клетки создают способную к гибкой адаптации систему жизнеобеспечения с разветвлениями во всех областях тела, в том числе кожи. Если бы не эта способность эндотелиальных клеток расширять и восстанавливать сеть кровеносных сосудов, рост тканей, процессы репарации были бы невозможны. Маркер CD146+ используется для идентификации мезенхимальных стволовых клеток эмбрионального происхождения. Его экспрессия может быть связана с мультипотентностью мезенхимальных стволовых клеток, а обнаружение – свидетельствовать о большом дифференциальном потенциале.
Антиген CD34+ представляет собой трансмембранный мономерный гликопротеин и экспрессируется на поверхности клеток-предшественников всех клеточных линий, а также на поверхности большинства примитивных плюрипотентных стволовых клеток. Самая высокая экспрессия антигена CD34+ наблюдается на поверхности большинства примитивных стволовых клеток с постепенным снижением экспрессии по мере дифференцировки линейно коммитированных клеток-предшественников клеточных линий. Антиген CD34 также присутствует на поверхности эндотелиоцитов капилляров и стромальных клеток, при этом его активированный фенотип – CD34+CD45dim.
Поскольку известно, что резидентные лимфоциты скорее, чем привлеченные из циркуляции, играют главную роль в кожном гомеостазе, выбор типа и количества флюоресцентных красителей всегда определяется задачами исследования, в рамках методологии осуществления которого необходимо выделение субпопуляций клеток кожи:
Т-лимфоциты – CD45+CD3+,
Т-хелперы – CD45+CD3+CD4+CD8-,
Т-супрессоры – CD45+CD3+CD4-CD8+,
В-лимфоциты – CD45+CD3-CD19+,
NK-лимфоциты – CD45+CD3-CD16+CD56+.
Резюмируя, уместно вспомнить Г.И. Рузавина, который в своей книге «Методология научного познания» под методом подразумевает упорядоченный и организованный способ деятельности, направленный на достижение определенной практической или теоретической цели. Изобретение метода первоначально связано с решением конкретных практических задач через выполнение ряда трудовых операций, с использованием при этом соответствующих приемов, средств или способов в строго определенном порядке.
«Под методом, – пишет Декарт, – я разумею точные и простые правила, строгое соблюдение которых всегда препятствует принятию ложного за истинное и – без лишней траты умственных сил, но постепенно и непрерывно увеличивая знания – способствует тому, что ум достигает истинного познания всего, что ему доступно». В качестве основных требований он рекомендует три правила метода: 1) начинать с простого и очевидного; 2) из него путем дедукции получать более сложные высказывания; 3) действуя при этом так, чтобы не было упущено ни единого звена, т.е. сохраняя непрерывность цепи умозаключений.
В дальнейшем идеи Декарта о дедуктивном характере метода науки на более широкой основе разрабатывал Г.В. Лейбниц, который стремился свести рассуждения к вычислениям, став предтечей современной символической, или математической, логики.
Этими тезисами я пытаюсь заложить и обосновать некую строгость в дальнейших суждениях, особенно необходимую при интерпретации получаемых результатов.
Закономерности, непосредственно проверяемые экспериментом, не изменяются. Конечно, их изменение мыслимо или логически возможно, однако эта возможность не учитывается эмпирической наукой и не влияет на ее методы. Напротив, научный метод предполагает неизменность естественных процессов, или «принцип единообразия природы».
Эта мысль позволяет исследователю предположить единообразие и даже параллелизм событий на разных уровнях исследования. Первый – наблюдаемый на поверхности кожи в виде клинических симптомов, другой – скрытый от глаз, но реализуемый на уровне клеток кожи и даже молекул, представленных на их поверхности. История дерматологии и клеточной биологии помнит массу попыток разделения клеточного субстрата кожи для получения суспензии и изучения фенотипа клеток, входящих в ее состав.
Однако способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи удалось открыть и запатентовать только в 2012 году.
