Стрела попавшая в цель летит вечно.
Набоков В.В.
Технические возможности проточной цитометрии, позволяющие анализировать субпопуляции клеток и идентифицировать любое их количество, а также измерять их поверхностные и внутриклеточные маркеры, оценивая их функциональное состояние, вместе с запросом врачей-дерматологов к более строгому пониманию патологических процессов на клеточном уровне обязывают к методологической стандартизации диагностических возможностей и подходов к измерению открывшегося разнообразия функциональных состояний клеточных фенотипов кожи для диагностической и лечебной практики.
Это уже привело к появлению новых вопросов к дерматологии, на которые существующая научная парадигма ответов не дает:
О каком состоянии кожи свидетельствуют те или иные составы клеток всех видов в конкретном образце ее биоптата?
Каково полное разнообразие признаков клеток всех видов?
Какие комбинации признаков клеток каждого вида создают в коже те или иные функции?
Каков полный состав возможных функций клеток кожи, возникающих в разнообразии комбинаций всех признаков клеток всех видов?
Какие функции возникают у тех или иных видов клеток при активации их конкретных долей в составе конкретного биоптата кожи?
Может ли клетка каждого вида выступать одновременно в функционально разных состояниях и в каких?
Существуют ли ограничения на возникновение субпопуляции клеток, способной демонстрировать различные фенотипы?
Каковы свойства клеточных фенотипов, образованных объединением определенных долей клеток каждого вида со своими функциями?
Какую структуру клеток, их признаков, функций, распределения долей клеток следует брать в качестве «единицы» измерения состояния кожи для ее прагматичного использования в исследовательской и лечебной практиках дерматологии будущего?
По мере расширения пространства этих вопросов объективно возникают трудности, связанные с использованием знаний о разнообразии функциональных состояний клеточных фенотипов кожи в диагностической и лечебной практике, с подходами к измерению этого разнообразия и подходами к разработке методов лечения.
Древнегреческое слово method обозначает путь к достижению какой-либо цели, которая в данной работе была определена как попытка концептуально обосновать применение проточной цитометрии для оценки фенотипического разнообразия клеток кожи человека. Достижение этой цели поможет решить научную проблему построения теории, объясняющей состояния кожи на уровне фенотипов её субпопуляций клеток, пригодной для практического и теоретического развития дерматологии и прагматичного использования знаний о последствиях динамики фенотипического разнообразия клеток кожи человека.
Г.И. Рузавин, в своей книге «Методология научного познания», под методом подразумевает упорядоченный и организованный способ деятельности, направленный на достижение определенной практической или теоретической цели. Изобретение метода первоначально связано с решением конкретных практических задач через выполнение ряда трудовых операций, руководствуясь при этом соответствующими приемами, средствами или способами в строго определенном порядке.
«Под методом, — пишет Декарт, — я разумею точные и простые правила, строгое соблюдение которых всегда препятствует принятию ложного за истинное — и, без лишней траты умственных сил, — но постепенно и непрерывно увеличивая знания, способствует тому, что ум достигает истинного познания всего, что ему доступно». В качестве основных требований он рекомендует три правила метода: 1) начинать с простого и очевидного; 2) из него путем дедукции получать более сложные высказывания; 3) действуя при этом так, что бы не было упущено ни единого звена, т.е. сохраняя непрерывность цепи умозаключений.
В дальнейшем идеи Декарта о дедуктивном характере метода науки на более широкой основе разрабатывал Г.В. Лейбниц, который стремился свести рассуждения к вычислениям, поэтому ставший предтечей современной символической, или математической, логики.
Этими тезисами я хочу заложить некую строгость в дальнейших суждениях. Особенно необходимых при интерпретации получаемых результатах.
«Закономерности, непосредственно проверяемые экспериментом, не изменяются. Конечно, их изменение мыслимо или логически возможно, однако эта возможность не учитывается эмпирической наукой и не влияет на ее методы. Напротив, научный метод предполагает неизменность естественных процессов, или «принцип единообразия природы».»
История дерматологии и клеточной биологии «помнит» массу попыток разделения клеточного субстрата кожи для получения суспензии и изучения фенотипа клеток, входящих в ее состав. Однако, способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи удалось открыть и запатентовать только в 2013 году.
Доклад «О перспективах применения цитоиммунограммы кожи». Докладчик доцент, к.м.н. Гольцов С.В.
Результаты исследований показали возможность получения суспензии клеток с жизнеспособностью в нативных образцах до 99,8%, а после криоконсервации образцов до 87,0%. Состоялось открытие, признанное перспективным для развития дерматологии и практичным для лечения кожных заболеваний. Резолюцией «Х международной конференции иммунологов Урала» патент был рекомендован к внедрению в систему общественного здравоохранения.
Президиум Х конференции иммунологов Урала с международным участием, посвященной памяти заслуженного деятеля науки РФ, профессора, д.м.н. Тепловой С.Н., г. Тюмень, 2012 Кашуба Э.А., ректор Тюменской государственной медицинской академии, профессор, д.м.н.; Брынза Н.С., первый заместитель директора Департамента здравоохранения Тюменской области, заведующая кафедрой организации здравоохранения и общественного здоровья Тюменской государственной медицинской академии, профессор, д.м.н.; Черешнев В.А., академик РАН и РАМН, Президент Российского научного общества иммунологов и Уральского общества иммунологов, аллергологов и иммунореабилитологов, директор Института иммунологии и физиологии УрО РАН, председатель Комитета Государственной Думы Федерального собрания РФ по науке и наукоемким технологиям, профессор, д.м.н.; Мельников В.П., академик РАН, директор Тюменского научного центра СО РАН, профессор, д.г.н.; Тузанкина И.А., учёный секретарь Института иммунологии и физиологии УрО РАН, профессор, д.м.н.; Ярилин А.А., профессор, д.м.н.
Председатель Комитета Государственной Думы РФ, академик РАН и РАМН Черешнев В.И. О тюменской науке
Фоторепортаж с конференции можно посмотреть в галерее
Научная деятельность, через методологию познания, рассматривает реальную картину мира и служит основным способом трансформации научного знания в практическую деятельность.
Реализуется это посредством изобретения методов научного исследования, либо (как это состоялось в нашем исследовании), совершенствовании имеющегося.
Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии позволяет охарактеризовать клетки при помощи моноклональных антител и дает возможность судить об их типе и функциональном состоянии по наличию того или иного набора клеточных маркеров и происходящих в них процессах. Как метод измерения характеристик клеток, проточная цитометрия, появилась в результате синтеза знаний о традиционных гистохимических и цитохимических методах анализа. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиагностике, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т.д.
Информация, извлекаемая методом проточной цитометрии, позволяет судить о морфологических характеристиках клеток (размере, отношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток). Но, дальнейшее развитие технологии привело к тому, что у исследователей появился в руках ещё и такой инструмент, как моноклональные антитела, предоставившие возможность типировать клетки не только благодаря их морфологическим различиям, но и за счет набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для определенных клеток и их функционального состояния.
Одновременно с ознакомлением с возможностью метода, были выявлены вызовы к дерматологии, исходящие от усложнения кожных патологий, сопровождающиеся значительными изменениями клеток кожи и их функций. Как выяснилось позже, это выражается как в изменении количества клеток, так и в появлении на их поверхности определенных функциональных молекул, в своей совокупности характеризующих определенные клинические состояния.
Экспериментальное построение цитоиммунограмм кожи проводится инвазивным способом, включающим в себя забор биоптата кожи на глубину 2 мм с ягодичной области человека с помощью инструмента для биопсии DERMO-PUNCH 2 мм (STERYLAB, Италия).
Панч-биопсия – способ взятия образца кожи с помощью специального трубчатого скальпеля – панча (от англ. punch – дырокол, компостер). Способ позволяет получить цилиндрический образец ткани заданной высоты и диаметра. При взятии материала панч направляют перпендикулярно поверхности кожи, растягивая кожу по сторонам. При этом на панч слегка надавливают сверху вниз и вращают его по и против часовой стрелки до погружения на требуемую глубину. После панч аккуратно извлекают. С помощью иглы из полости скальпеля извлекают биоптат и при помощи острых ножниц или лезвия отделяют нижнюю часть образца от тела пациента. При необходимости на образовавшуюся ранку накладывают швы и бактерицидный пластырь.
Биоптат кожи и 1 мл 0,9 % водного раствора хлорида натрия помещается в рабочую камеру автоматической системы для механической гомогенизации ткани Medimachine (Becton Dickinson, США).
После чего гомогенат фильтруется через инертный фильтр для клеток Falcon (Becton Dickinson, США) с нейлоновой сетчатой структурой и диаметром пор 20 мкм.
Технический результат достигается инвазивным отбором биоптата кожи человека с помощью инструмента для биопсии DERMO-PUNCH 2 мм (STERYLAB, Италия).
Далее биоптат кожи и 1 мл 0,9 % водного раствора хлорида натрия помещается в рабочую камеру автоматической системы для механической гомогенизации ткани Medimachine (Becton Dickinson, США).
После чего гомогенат фильтруется через инертный фильтр для клеток Falcon (Becton Dickinson, США) с нейлоновой сетчатой структурой и диаметром пор 20 мкм.
Гомогенизация ткани проводится в течение 30 секунд при температуре +23°С. Гомогенат извлекается стерильным шприцем. Рабочая камера гомогенизатора трижды вымывается 0,9% водным раствором хлорида натрия по 1 мл. Гомогенат фильтруется через фильтр для клеток Falcon (Becton Dickinson, США) с нейлоновой сетчатой структурой и диаметром пор 20 мкм. Далее гомогенат центрифугируется для удаления надосадочной жидкости при 400 g в течение 5 минут при температуре + 23°С.
После этого, определяется жизнеспособность клеток с помощью внутриклеточного красителя 7-amino-actinomycin D RUO (7AAD) (Beckman Сoulter, США). Анализ проводится на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (Beckman Сoulter, США). Идентификация клеток выполняется путем регистрации двух параметров: бокового светорассеяния (side scatter) и регистрацией флюоресценции по 3 каналу (FL3).
Полученный образец кожи можно исследовать ex tempora, либо после длительной криоконсервации. Для второго варианта, проверенный на стерильность образец помещается в криопробирку Costar 2 мл с раствором для замораживания (90% Fetal Bovine Serum и 10% DMSO в качестве криопротектора), затем образец замораживается в парах жидкого азота t°-140°C со скоростью 1°C в минуту, методом витрификации.
Программный замораживатель
В любом случае, что при первом – нативном, что втором варианте (после размораживания), клетки кожи инкубируются в течение 20 минут в защищенном от света месте с моноклональными антителами, конъюгироваными с флюорохромами флюоресцеинизотиоцианатом (FITC), фикоэритрином (РЕ), PE – Texasred (ESD), PE/CY5(PC5), PE/CY7(PC7) (Beckman Сoulter, США).
Методом проточной цитометрии проводится фенотипирование клеточной суспензии на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (Beckman Сoulter, США) используя специфические маркеры: CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD34, CD44, CD45, CD49, CD54, CD63, CD80, CD146, CD203c; CD207, CD249 с помощью которых идентифицируются субпопуляции клеток и определяется их фенотип.
Поскольку известно, что резидентные клетки скорее, чем привлечённые из циркуляции, играют главную роль в кожном иммунном гомеостазе, выбор типа и количества флюоресцентных красителей определялся задачей исследования для которой необходимо выделение субпопуляций клеток кожи, наиболее влияющих на патогенез широко встречаемых заболеваний кожи.
Фенотипирование клеток кожи проводилось с помощью специфических маркеров
Зная о том, что кератиноциты составляют более 90% клеток верхнего слоя кожи – эпидермиса, а клетки дермы в подавляющем большинстве представлены фибробластами (фиброцитами), тучными клетками, моноцитами (макрофагами), эндотелиальными, дендритными клетками и лимфоцитами, из которых 90% – Т-лимфоциты, расположенные в верхних слоях дермы и эпидермисе, а 10% – В-лимфоциты, представленные в средних и глубоких слоях дермы, были определены наборы маркеров дифференцирования клеток, наиболее точно характеризующих динамику состояний этих субпопуляций.
Это решение позволило усовершенствовать метод проточной цитометрии до возможности получения оценок количественного и качественного состава отдельных субпопуляций клеток кожи:
Для регистрации получаемых результатов был разработан бланк медицинского документа «Цитоиммунограмма кожи», в котором представлен состав клеток кожи, с указанием фенотипа каждой субпопуляции для заполнения лаборантом числовых данных в относительных и/или абсолютных единицах по результатам исследования.
В верхней части документа указаны эмблема медицинского учреждения, знак обслуживания, почтовый адрес, контактные телефоны, сайт медицинского учреждения, а также свободные участки для заполнения лаборантом идентификационного номера цитоиммунограммы кожи с датой проведения анализа, фамилии имени отчества пациента и его возраста.
В средней части документа в две колонки представлен состав клеток кожи, с указанием фенотипа каждой популяции. Напротив каждой группы клеток кожи предусмотрены пустые поля в виде сдвоенных прямоугольников для заполнения лаборантом числовых данных в относительных и/или абсолютных единицах по результатам исследования. Представленные числовые данные указывают количество клеток кожи определенного фенотипа.
В нижней части документа имеются свободные участки, предназначенные для заполнения врачом информации о результатах исследования фенотипа клеток кожи, которые могут свидетельствовать: о динамической оценке течения заболевания, эффективности использования назначенных лекарственных или косметических средств, оценке возрастных изменений кожи, индивидуальном подборе лекарственных препаратов, оценке степени реагирования клеток кожи на те или иные воздействия. Также заполняются лаборантом в свободные участки сведения об исполнителе и враче, направившим на проведение анализа.
В перспективе широкомасштабного применения, этот метод исследования кожи позволит создать половозрастной регистр состояния кожи, объективно оценивать динамику заболеваний кожи, индивидуально подбирать лекарственные препараты, контролировать эффективность применения наружных лекарственных средств, формировать критерии возрастных изменений кожи, объективно свидетельствовать о текущем статусе местного иммунитета пациента и может стать содержательной основой лечебно-профилактических программ в дерматологии.
Результаты иммунологических исследований субпопуляций клеток кожи открывают картину, по отношению к которой современная дерматология еще не имеет отчетливого отношения. Но, воплощение в эффективные средства уже первых полезных феноменов этой картины указывает на то, что в этой научной дисциплине начинается новая история.
